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发布于 2023-08-21
染色质免疫沉淀(ChIP)是一种研究蛋白质与染色质DNA相互作用的技术,根据不同目的既可用于鉴定互作蛋白,也可用于鉴定互作DNA。通常被用于表观遗传学研究,如通过ChIP检测转录调节相关的组蛋白修饰。
操作步骤:
一、 样品准备(操作样品在冰上或4℃进行。)
对于悬浮细胞, 确保10 ml新鲜培养基中有合适数量的细胞,直接加37%甲醛至终浓度为1%。摇晃混匀后,室温下摇床孵育10 min。
对于组织, 液氮充分研磨组织至粉末状。然后转移至15 ml或50 ml尖底管中,加入10 ml PBS(Cat No. PR20023)和 270 μl 37%甲醛至终浓度为1%。摇晃混匀后,室温下摇床孵育10 min。
加入500 ul 2.5 M甘氨酸(至终浓度0.125 M)终止反应,室温孵育5 min。
细胞转至50 ml尖底管中,4℃、2500 rpm离心5 min。
弃上清,冰预冷PBS(pH 7.4)洗涤细胞2次,每次洗涤后4℃、2500 rpm离心5 min。
用1 ml冰预冷细胞裂解液(Cat No. PR20001,现加蛋白酶抑制剂(Cat No. PR20016)),重悬细胞。为促进细胞膜的破裂,用Douncer玻璃匀浆器匀浆细胞5~10次,4℃孵育15 min。
4℃、4000 rpm离心5 min,弃上清。
细胞裂解液重新细胞核 (每3-5 x 106 个细胞加100 ul裂解液)。
冰上超声5~15 min(25%功率,超声20s、停30s),最佳超声条件需要根据预实验确定。
4℃、12000 rpm离心5 min,转移上清至新EP管中,直接进行后续试验,或冻存-20℃备用。
二、DNA断裂效果检测
取50 ul染色质上清,加入150 ul ddH2O,10 ul 5M NaCl,65 ℃ 4 h或过夜,解交联。
加入RNaseA至终浓度50 μg/ml,37 ℃孵育30 min。
加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml,42 ℃孵育30 min。
剂盒纯化DNA片段。
1.5 %琼脂糖胶电泳检测。
三、免疫沉淀(按单个CHIP反应)
准备70 ul磁珠。
用600 μl含5 %BSA的PBS,洗涤磁珠2次。
第二次洗涤后,重悬磁珠至初始体积。
取100 ul细胞裂解物(约含20 ug 染色质,具体因细胞及制样不同而异),1:10稀释至1 ml。
取25 ul洗好的磁珠,加至细胞裂解物中,进行lysate 预吸附处理。
剩余45 ul磁珠,加入2-5 ug相应抗体,4 ℃旋转孵育过夜。(使用非特异性的IgG,作为阴性抗体对照)。
将步骤5 中样品,磁性分离,转移预吸附后的lysate至新EP管中。
用300 ul 冰预冷的 PBS(含5% BSA),洗涤步骤6后的抗体-磁珠复合物2次,弃上清。
加入预吸附后的lysate(留50 ul冻存备用)至抗体-磁珠复合物中,4 ℃旋转孵育2 h。
瞬离样品,然后置于磁力架上。
每次1 ml低盐洗涤液,洗涤2次。
每次1 ml高盐洗涤液,洗涤2次。
每次1 ml LiCl洗涤液,洗涤2次。
每次1 ml TE溶液,洗涤2次。第2次洗涤时,转移样品至新EP管中。
最后洗涤结束,移液器尽弃洗涤液。
准备Elution buffer,恒温浴调至65 ℃。
加入100 ul Elution buffer至每个样品中(步骤15后),65 ℃孵育10 min。
转移洗脱液至新EP管,并重复步骤17一次,最终收集到200 ul。
取之前预吸附后的lysate 50 ul,作为 5% Input。补加150 ul Elution buffer,至总体积200 ul。
分别向CHIP洗脱样品(步骤18后)和Input中加入10 ul NaCl(5 M 母液),65 ℃孵育过夜进行解交联。
四、DNA纯化和分析:
加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml,42 ℃孵育1 h。
试剂盒纯化DNA片段。
PCR检测及分析。